關(guān)于液相色譜的定量分析

         關(guān)于液相色譜的定量分析   

定量分析是在定性分析的基礎(chǔ)上，需要純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。液相色譜的定量是相對(duì)的定量方法，即：由已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品推算出被測(cè)樣品的量。

液相色譜法定量的依據(jù)被測(cè)組分的量(W)與響應(yīng)值(A)（峰高或峰面積）成正比,W=f×A。定量校正因子(f)：是定量計(jì)算公式的比例常數(shù)，其物理意義時(shí)單位響應(yīng)值（峰面積）所代表的被測(cè)組分的量。由已知標(biāo)準(zhǔn)樣品的量和其響應(yīng)值可以求得定量校正因子。測(cè)定未知組分的響應(yīng)值，通過(guò)定量校正因子即可求得該組分的量。定量分析常用術(shù)語(yǔ)：樣品（sample）：含有帶測(cè)物，供色譜分析的溶液。分為標(biāo)樣和未知樣。標(biāo)樣（standard）：濃度已知的純品。未知樣（unknow）：濃度待測(cè)的混合物。樣品量（sample weight）：待測(cè)樣品的原始稱(chēng)樣量。稀釋度（dilution）：未知樣的稀釋倍數(shù)。組分（componance）：欲做定量分析的色譜峰，即含量未知的被測(cè)物。組分的量（amount）：被測(cè)物質(zhì)的含量（或濃度）。積分（integerity）：由計(jì)算機(jī)對(duì)色譜峰進(jìn)行的峰面積測(cè)量的計(jì)算過(guò)程。校正曲線(xiàn)（calibration curve）：組分含量對(duì)響應(yīng)值的線(xiàn)性曲線(xiàn)，由已知量的標(biāo)準(zhǔn)物建立，用于測(cè)定待測(cè)物的未知含量。常用的定量方法1外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法在液相色譜中用的zui多。內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確但是麻煩，在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的zui多。用被測(cè)化合物的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成一系列的已知濃度的標(biāo)樣。注入色譜柱的到其響應(yīng)值（峰面積）。 
在一定范圍內(nèi)，標(biāo)樣的濃度與響應(yīng)值之間存在較好的線(xiàn)性關(guān)系，即W=f×A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

在*相同的實(shí)驗(yàn)條件下，注入未知樣品，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度。

 

外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：操作、計(jì)算簡(jiǎn)單，是一種常用的定量方法； 無(wú)需各組分都被檢出、洗脫；需要標(biāo)樣；標(biāo)樣及未知樣品的測(cè)定條件要一致；進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確。
外標(biāo)法缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)條件要求高，如檢測(cè)器的靈敏度，流速、流動(dòng)相組成的不能發(fā)生變化；每次進(jìn)樣體積要有好的重復(fù)性。2內(nèi)標(biāo)法

操作：

將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，制成混合標(biāo)樣，并配制一系列的已知濃度的工作標(biāo)樣?；旌蠘?biāo)樣中標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)樣的摩爾比不變。注入色譜柱，以（標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)樣峰面積）為響應(yīng)值。根據(jù)響應(yīng)值與工作標(biāo)樣濃度之間存在的線(xiàn)性關(guān)系，即W=f×A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度。
內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)：操作過(guò)程中樣品和內(nèi)標(biāo)是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)的量的比值恒定，上樣體積的變化不會(huì)影響影響定量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)法抵消了上樣體積，乃至流動(dòng)相、檢測(cè)器的影響，因此比外標(biāo)法。案例分析案例分析一我做的是苯酚羥基化反應(yīng)，產(chǎn)物中有苯酚，苯二酚（鄰，對(duì)），苯醌，焦油，用安捷倫1100液相色譜分析，外標(biāo)法計(jì)算選擇性和轉(zhuǎn)化率。但一直以來(lái)，計(jì)算出的結(jié)果老是差強(qiáng)人意。偶爾算出一個(gè)好的結(jié)果，但是一重復(fù)又不行了，有時(shí)候重復(fù)做幾次都不一樣，很是郁悶。zui近又老算出來(lái)選擇性超過(guò)100%。開(kāi)始懷疑稀釋誤差的問(wèn)題（樣品是稀釋以后去測(cè)的)，但現(xiàn)在操作的時(shí)候非常小心了，懷疑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的問(wèn)題，但是重新做了好幾條了。結(jié)果就是很奇怪，自己想了想：1.因?yàn)橐合嗌V儀是公用的，所以特意買(mǎi)了的色譜柱。但經(jīng)常測(cè)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)柱壓不一樣，是不是因?yàn)檫@個(gè)影響了峰面積，進(jìn)而影響了結(jié)果？柱壓的影響這么大么？2.是不是外標(biāo)法就不準(zhǔn)確？該用單點(diǎn)校正法？之前覺(jué)得每次測(cè)樣前都配一個(gè)標(biāo)樣有點(diǎn)麻煩，所以沒(méi)用。3.還是別的什么原因？補(bǔ)充：用的柱子是ZORBAX SB-C18, 用的甲醇：水=3：7，每個(gè)峰都分的很開(kāi)。取樣后離心去掉催化劑，再定量稀釋然后去測(cè)的。

網(wǎng)友七嘴八舌：

 

- 有時(shí)候確實(shí)柱壓不同會(huì)對(duì)結(jié)果有影響，但這是柱壓差別很大的情況才會(huì)發(fā)生。是不是柱子沒(méi)沖洗好，或者需要看是否進(jìn)氣泡了，因?yàn)檫@都可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)。

- 如果柱壓的差別很大的話(huà)，比如30bar已經(jīng)很大了，平時(shí)用的時(shí)候，有柱溫箱，一般都控制溫度恒定的，基本同意條件不會(huì)有這么大的變化，zui多10bar上下浮動(dòng)，通常小于5bar。

- 是不是走過(guò)緩沖鹽的流動(dòng)相？用水低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗，再換乙腈沖洗試試看。是不是有些不物殘留在柱子中沒(méi)有及時(shí)沖洗導(dǎo)致柱壓偏高，可以嘗試用異丙醇試試。

- 柱壓變化主要會(huì)影響保留時(shí)間，對(duì)峰面積影響不大。你所說(shuō)的重復(fù)性不好，是液相進(jìn)同一個(gè)樣品重復(fù)不好還是不同的樣品。如果不同的樣品那是你反應(yīng)的問(wèn)題。至于選擇性超過(guò)100%？是否是計(jì)算方法錯(cuò)誤？

- 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，計(jì)算苯二酚的選擇性：

假設(shè)對(duì)苯峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得濃度C1(g/ml)；鄰苯峰面積對(duì)應(yīng)濃度C2，苯酚峰面積對(duì)應(yīng)濃度C，溶液總體積V，稀釋倍數(shù)20，初始苯酚加入量m(g),如下

 

- 計(jì)算公式如果沒(méi)錯(cuò)，可以看看是否自己沒(méi)有做過(guò)空白以及反應(yīng)投料時(shí)的組分測(cè)試。

- 至于單點(diǎn)還是外標(biāo)法？

單點(diǎn)校正比較簡(jiǎn)單，如果要求不是很?chē)?yán)格的話(huà)，單點(diǎn)校正可以滿(mǎn)足要求。單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)濃度如果在被測(cè)樣品濃度附近，結(jié)果比外標(biāo)法更準(zhǔn)確。做考核樣時(shí)，我們一般先用外標(biāo)法定出大致濃度范圍，再以單點(diǎn)法定量。

單點(diǎn)一般適用于線(xiàn)性曲線(xiàn)截距在100%濃度點(diǎn)2%以下的。高于20%不能采用單點(diǎn)校正和外標(biāo)。外標(biāo)法對(duì)照和拱式樣品濃度應(yīng)一致，校正曲線(xiàn)線(xiàn)性符合即可。

案例分析二我想用液相色譜進(jìn)行定量分析，使用外標(biāo)法。問(wèn)題是：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是不是每次測(cè)定樣品時(shí)都要做一次？我有200個(gè)樣品，但不是一次能做好，每次我可以測(cè)20個(gè)樣品。難道我每次測(cè)定前都要先做一下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)？我是同一臺(tái)儀器，同一條件。網(wǎng)友七嘴八舌：

從嚴(yán)格意義上來(lái)講應(yīng)該是每天做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果你做的東西要求不是太嚴(yán)格（不需要報(bào)批），可以考慮隔幾天做一天標(biāo)曲。不可否認(rèn)的是，每天都做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能減小測(cè)量的數(shù)據(jù)的誤差。

但是如果是藥品檢測(cè)，是應(yīng)該每次開(kāi)機(jī)測(cè)定樣品前做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或單點(diǎn)校正標(biāo)準(zhǔn)溶液分析，但普通化工分析要求不嚴(yán)就沒(méi)有必要每次做曲線(xiàn)，因?yàn)椴町惒淮蟮?。但如果是檢測(cè)單位檢測(cè)樣品，就要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)執(zhí)行了。說(shuō)白了其實(shí)是規(guī)范不規(guī)范的問(wèn)題。